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服務(wù)名稱:    多克隆抗體制備服務(wù)
提供商:      上海研謹(jǐn)生物
規(guī)格:        實(shí)驗(yàn)代做服務(wù)
價(jià)格：8000元
收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)/服務(wù)周期/提供結(jié)果:
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多抗一般制備流程:完全抗原的準(zhǔn)備- +兔子的免疫-→ 效價(jià)檢測(cè)和終放- +抗體親和純化- +抗體的濃縮和保存。
 
具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:
 
1.兔子的準(zhǔn)備
 
挑選健康的6周大小的新西蘭大白兔兩只(約2Kg) ，使其適應(yīng)新的生活環(huán)境，至少穩(wěn)定幾天再進(jìn)行首次取血、預(yù)采血(作陰性參照用)
1.1將兔子小心的放入固定的架中，使兔子平靜;
1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可見(也可不剃);
1.3如果有必要，可用小棉球沾酒精涂抹血管部位使血管膨脹;
1.4用注射器從耳靜脈抽取約10ml血液(約5ml血清);
1.5小心抽出針頭，適當(dāng)按壓傷口以免流血，然后用酒精棉球消毒傷口;
1.6將收集的血液置于37 C滅活30min,最后置于4" C過夜使其凝結(jié)釋放血清;
1.7將凝結(jié)好的血液在10000r / min離心10min; h.收集 上清，即為血清。
 
兔子的免疫
2.1注射兩只兔子的抗原為1ml,抗原緩沖溶液必須不含對(duì)兔子有害的化學(xué)試劑每只兔子初次免疫400ug抗原比較適合，也可適當(dāng)減少以獲得更好的結(jié)果，后續(xù)免疫每次為100ug即可。
2.2將1m的佛氏完全佐劑與準(zhǔn)備好的1m抗原充分混勻，呈乳白色; .
2.3小心從籠中取出兔子,織兔子免疫4個(gè)部位(背部和大腿根部均可)，每個(gè)部位250ul,針頭呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留數(shù)秒以防止抗原外流。
2.4兔疫周期為20天，免疫完后7-10天取血(包括中途測(cè)試取血和最終放血)，總共免疫4-5次。
 
3.效價(jià)檢測(cè)
3.1 2個(gè)參照陰性參照為預(yù)取血血清，均以1抗起始濃度稀釋(封閉稀釋液);陽(yáng)性參照為以前
陽(yáng)性血清
3.2于96孔板中每孔滴加100ul, 1ug/m抗原，于49C過夜， 也可以37°C孵育2小時(shí)。
3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200u的封閉液， 49C過夜或者379C孵育2小時(shí)。
3.4倒去封閉液，在吸水紙上拍打盡量吸干殘留液體，用洗滌液洗板三次每次盡量拍干殘留液體，若要放置一段時(shí)間, 37°C烘干并用封口袋封好于20°C存放。
3.5取包被好的96孔板，第---孔加入陰性 參照液100ul,第二孔加入陽(yáng)性參照液100ul,第三孔加入1:500的待測(cè)抗血清，后續(xù)各孔在此基礎(chǔ)上倍比稀釋,于37°C孵育1 小時(shí)。
3.6倒掉液體，用洗滌液洗板三次,拍干。每孔加入100u的HRP標(biāo)記的小鼠抗兔lgG (1: 2000稀釋)，于37°C孵育45分鐘。
3.7倒掉液體，用洗滌液洗板三次，拍干。每孔加入100u的TMB底物(Sigma 單組份TMB ) 37°C孵育5-20分 鐘(根據(jù)顏色深淺來(lái)決定顯色的時(shí)間)。
3.8每孔加入50u的終止液(2N H2SO4)， 在酶標(biāo)儀上讀取波長(zhǎng)450nm處的吸光值。
抗體效價(jià)檢測(cè)達(dá)到100萬(wàn)以上后可以對(duì)兔子進(jìn)行終放血。
 
抗體的純化
 
4.抗體的親和--親和柱的制備
4.1 稱取1mg CNBr- Sepherose 4B的瓊脂糖凝膠加入2mmol/ L的鹽酸中，4" C過夜使其充分溶漲，可獲得3m溶漲膠。
4.2將凝膠轉(zhuǎn)移入純化柱中，用約20ml 2mmol / L的鹽酸洗介質(zhì)3次。
4.3用偶聯(lián)緩沖液洗介質(zhì)- -次，因?yàn)榛罨鶊F(tuán)在偶聯(lián)緩沖液PH值下易水解，所以此步驟zui好在幾分鐘內(nèi)完成。
4.4將溶解在5ml偶聯(lián)緩沖液中的5-10mg的抗原加入凝膠中
4.5室溫下輕輕混合搖動(dòng)2-4小時(shí)，或4" C過夜,如需測(cè)定結(jié)合效率此步驟結(jié)束后取少量溶液待測(cè)。用20ml的偶聯(lián)緩沖液洗介質(zhì)一-次。
4.6加入15m1 1% BSA溶液室溫下孵育2小時(shí)或4" C過夜。
4.7用磷酸鹽緩沖液洗滌介質(zhì)3次以上,每次15m以上h.
4.8抗原固相化完成，可用于純化。
4.9若不立即使用或者使用后，用20%的乙醇封存。
 
5.抗血清的純化和保存
5.1抗血清用PBS等體積稀釋，5000-10000 / min離心15分鐘，取上清.
5.2用10倍體積的PBS清洗抗原親和柱以平衡柱子。
5.3將稀釋好的抗血清10m加入平衡好的柱子中。
5.4室溫下輕輕混合搖動(dòng)2-4小時(shí)，或4" C過夜
5.5用10倍體積的PBS清洗抗原柱，以洗去結(jié)合在柱子上的雜蛋白
5.6用2倍體積的抗體洗脫液洗滌柱子，以得到特異性抗體
5.7用10倍體積PBS平衡柱子
5.8用20%的酒精封存柱子，4'C保存。
在得到洗脫的抗體后，經(jīng)蔗糖或聚乙二醇濃縮后于PBS中透析除鹽，使用紫外可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)280nm處測(cè)定抗體OD值，所得OD值除以1.35即為所測(cè)抗體的濃度，添加40-50%甘油置于20^C可長(zhǎng)期保存。

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